وب هکس

میکروبیولوژی 88 لاهیجان - همه چیز در مورد تست الایزا ELISA
میکروبیولوژی 88 لاهیجان
صفحه نخست       پست الکترونیک          تماس با ما              ATOM            آپدیت روزانه nod32
گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من




درباره وبلاگ


به یاد ورودی های 88 لاهیجان ♥

مدیر وبلاگ : مصطفی
نویسندگان
نظرسنجی
نظرتون راجع به این وب چیه؟










تعداد بازدید :
آنتی‌ ژن‌ها را به سادگی ردیابی كنید معرفی روش ELISA

ELISA مخفف عبارت Enzyme-Linked Immunosorbent Assay  یك روش آزمایشگاهی بیوشیمیایی ساده با حساسیت بسیار بالا است كه امكان آنالیز تعداد زیادی نمونه را به صورت همزمان فراهم می كند. این روش در ایمونولوژی (ایمنی شناسی) برای تشخیص وجود یك آنتی بادی یا آنتی ژن در نمونه مورد آزمایش استفاده می شود كه عموما به عنوان ابزاری تشخیصی در پزشكی و پاتولوژی و همچنین تست كنترل كیفیت در بسیاری از صنایع كاربرد دارد.

ELISA بر پایه اندازه گیری كمپلكس رنگی آنتی‌ژن و آنتی‌بادی استوار است. به این ترتیب كه نمونه مورد آزمایش با مقدار نامشخصی آنتی ژن روی فاز جامد (معمولا پلیت پلی استیرن) ریخته می شود، سپس آنتی بادی بازیابی اضافه می‌شود تا با آنتی ژن واكنش داده و تركیبی ایجاد كند. آنتی بادی بازیابی با آنزیم پیوندی كووالانسی برقرار می كند. بین هر مرحله پلیت با محلول پاك كننده ملایمی شسته می شود تا هر پروتئین یا آنتی بادی باقیمانده شسته شود. پیش از آخرین مرحله شستشو، پلیت با اضافه كردن زیر لایه آنزیمی كشت داده می شود و ماده رنگی تولید می‌شود. طول موج رنگ به دست آمده توسط یك دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت شده و ثبت می‌شود كه این طول موج معرف حضور یك آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن و نیز غلظت آن است. در ELISA های قدیمی تر زیرلایه رنگ‌زا به كار گرفته می‌شد در حالیكه در تست های جدیدتر زیرلایه های فلوروژنیك با حساسیت بسیار بالاتر مورد استفاده قرار می گیرد.
امروزه ELISA یكی از قدرتمند ترین روش های آزمایشگاهی برای پی بردن به اختلالات سیستم ایمنی است، این تست به منظور پی بردن به آنتی‌ژن ناشی از ارگانی عفونی در بدن یا مواد غیر نرمالی كه معرف برخی بیماری‌ها است انجام می شود. همچنین آنتی بادی‌هایی كه در پاسخ به برخی عفونت‌ها یا بیماری‌ها به‌وجود آمده نیز توسط این تست قابل تشخیص هستند. تست ELISA اولین آزمایش متداول در غربال‌زنی HIV است. در تست ELISA سرم فرد 400 بار رقیق شده و به صفحه ای كه حاوی آنتی‌ژن HIV است اضافه می‌شود. اگر آنتی بادی HIV در سرم وجود داشته باشد، به این  آنتی‌ژن های HIV می چسبد. سپس به منظور از بین بردن دیگر اجزا سرم، پلیت شستشو داده می شود. یك "آنتی بادی ثانویه" ساخته شده مخصوص (یك آنتی بادی چسبیده به آنتی بادی دیگری) به پلیت اعمال شده و شستشوی دیگری انجام می‌شود. این آنتی بادی ثانویه به صورت شیمیایی به آنزیم از پیش تهیه شده می‌چسبد. این‌بار زیر لایه ای برای آنزیم اعمال شده و توسط آنزیم كاتالیز می‌شود كه منجر به تغییر رنگ در فلورسانس می شود.
نتایج ELISA به صورت عددی گزارش می‌شود. بحث‌انگیزترین وجه این تست تعیین نقطه برش بین نتایج مثبت و منفی است.
علاوه بر آزمایش HIV از ELISA برای آزمایش بیماری‌هایی چون هپاتیت، تب استخوان‌شكن، leptospirosis ، عفونت انگلی، تبخال، سرخجه و دیگر عفونت‌های ویروسی و باكتریایی استفاده می‌شود.
پیش از پیدایش روش ELISA ، تنها گزینه برای انجام سنجش ایمنی، ایمنی سنجی رادیویی بود، كه از آنتی ژن ها و آنتی بادی هایی كه به صورت رادیواكتیو ممیز شده بودند استفاده می‌شد. در این روش در صورت وجود آنتی بادی یا آنتی‌ژنی خاص، رادیواكتیویته سیگنالی تولید می‌كرد. تئوری روش ایمنی سنجی رادیویی اولین بار سال 1960 توسط Rosalyn Sussman Yalow و Solomon Berson مطرح شد. از آنجایی‌كه رادیواكتیویته خطرات زیستی داشت، پیشنهاد امن تر و ایمن تری مبنی بر جایگزینی سیگنال های غیر رادیو اكتیو به جای سیگنال های رادیو اكتیو ارائه شد. وقتی یك آنزیم مشخص (مانند پر اكسیداز) با زیر لایه مناسب واكنش می دهد، منجر به تغییر رنگ آن می‌شود كه می تواند به عنوان سیگنال استفاده شود. البته باید تناسب بین سیگنال و وجود آنتی‌بادی یا آنتی ژن تعیین می‌شد كه این پروسه توسط  Stratis Avrameas و G.B. Pierce انجام شد. در سال 1966 توسط  Wide و  Porath این روش تكمیل تر شد. و در سال 1971  Peter Perlmann و  Eva Engvall نهایتا به روش ELISA به شیوه امروزی دست پیدا كردند. ELISA امروزی مزایای زیادی نسبت به روش‌های ایمنی سنجی رادیویی دارند. از جمله عدم وجود خطر تشعشع، امكان اتوماسیون، امكان افزایش حساسیت روش، عمر طولانی كیت های آنزیمی، سرعت خوانش بالا و قیمت ارزان‌تر دستگاه‌ها و معرف ها.
تست ELISA با روش‌های گوناگونی انجام می‌شود كه كه به صورت كلی به دو دسته ELISA  مستقیم و غیر مستقیم تقسیم بندی می‌شود. در روش مستقیم آنتی ژن یا آنتی‌بادی مورد نظر به طور مستقیم بر سطح فاز جامد پوشش داده می شود و سپس آنتی‌بادی یا آنتی ژن مكمل نشاندار شده آن به سیستم اضافه می‌شود. با آنالیز سیگنال تولید شده می‌توان پی به وجود آنتی ژن یا آنتی بادی مورد نظر در نمونه برد. این روش ارزش تشخیصی چندانی نداشته و بیشتر كاربرد تحقیقاتی دارد.
در روش غیر مستقیم سرم رقیق شده به آنتی ژن های پوشش داده شده در فاز جامد اضافه می شود، سپس نمونه را به آن اضافه كرده و پس از گذشت زمان انكوباسیون و یك مرحله شستشو، آنتی هیومن گلوبولین نشاندار شده با آنزیم به چاهك اضافه می شود. این روش برای تعیین آنتی بادی اختصاصی یا تیتراسیون آنتی بادی در سرم استفاده می‌شود.  ‌
روش های ELISA ساندویچ و ELISA رقابتی یا مهاری از دیگر انواع متداول این تكنیك هستند. روش ساندویچ كه متداول‌ترین روش ELISA است، یك آنتی ژن در بین دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گیرد. روش های رقابتی نیز بر پایه رقابت دو آنتی ژن یا دو آنتی بادی برای اتصال لیگاند با مقدار محدود استوار است. اگر اضافه كردن هردو آنالیت به سیستم همزمان انجام شود، روش را رقابتی می نامند ولی چنانچه ابتدا آنالیت اضافه شده و پس از یك دوره زمانی انكوباسیون آنالیت نشاندار اضافه گردد روش را مهاری می نامند.
مراحل انجام یك آزمون ELISA كه تقریبا در تمام انواع آن مشترك است عبارت است از:
1) پوشش دهی، كه به معنی جذب یك آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی با سطوح جامد است.
2) اضافه كردن نمونه‌های مورد آزمایش.
3) گذشت مدت زمان كافی  برای انجام واكنش كه به اصطلاح انكوباسیون واكنشگرها نامیده می شود.
4) انجام عمل شستشو توسط واشر ELISA ، به منظورجدا كردن واكنشگرهای متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهای آزاد و متصل نشده  ‌.
5) اضافه عوامل لینك شده با آنزیم.
6) مجددا طی مدت زمان انكوباسیون برای واكنشگرها  ‌.
7)استفاده مجدد از واشر ELISA جهت انجام عمل شستشو  ‌.
8) افزودن زیرلایه آنزیم جهت تشخیص واكنش دهنده‌ها.
9) طی زمان انكوباسیون.
10) اتمام واكنش آنزیمی توسط متوقف كننده‌ها و خوانش دانسیته نوری به دست آمده توسط خواننده .ELISA
برای انجام تست ELISA باید نمونه خون از بیمار گرفته شود و سرم آن جدا شود. برای این كار باید به مواردی دقت داشت. مثلا از بستن گارو برای مدتی طولانی باید اجتناب كرد چرا كه ممكن است در پارامترهای مورد اندازه گیری تاثیر گذاشته و موجب بروز خطا شود. در هنگام جداسازی سرم نیز باید دقت شود كه فیبرینوژن یا ذرات دیگر نباشد. پیش از انجام آزمایش باید به كیفیت كیت های مورد مصرف توجه كرد، همچنین نگهداری آن‌ها باید در دمای­C 8-2 صورت گیرد. تمامی محلول‌های موجود در كیت قبل از مصرف بایدخوب مخلوط شده و به دمای آزمایشگاه برسد و پس از استفاده  به منظور افزایش پایداری، بلافاصله اجزاء كیت به یخچال منتقل شود. درحین انجام آزمایش باید از نوسانات غیر تدریجی دما در هنگام انكوباسیون، مانند باز بودن پنجره یا درب آزمایشگاه در محل آزمایش جلوگیری كرد. ایجاد پدیده هوك باعث ایجاد نتایج پایین كاذب می‌شود لذا توصیه می‌شود برای جلوگیری از این پدیده سرم رقیق نشده و سرم یك دهم رقیق شده، مخلوط وآزمایش را انجام دهیم، تا اثر احتمالی هوك اصلاح شود. از آنجا كه فریز و دیفریز كردن نمونه ها باعث كاهش سطح برخی از هورمون ها می‌شود، باید تا حد ممكن از این كار  پرهیز شود. پیش از اندازه گیری باید كلیه ابزارهای مورد استفاده اعم از نوك ابزار نمونه‌گیری و كیت ها استریل شوند. كه البته استفاده از ابزارهای یكبار مصرف پیشنهاد می‌شود و باید قبل از استفاده لوله آزمایش های شیشه‌ای آن‌ها را با اسید سولفوریك رقیق شستشو داده و با آب مقطری كه دوبار تقطیر شده آبكشی انجام داد. از  به كار بردن محلول‌های شستشوی نامناسب یا آب مقطر ناخالص باید پرهیز كرد. ضمنا باید از كاركرد صحیح دستگاه‌ها و تجهیزات مورد استفاده به عنوان مثال از صحت طول موج فیلترهای  خواننده ELISA به كمك استفاده از ماده رنگی با ثبات، نظیر بیكرومات پتاسیم یا عملكردصحیح دستگاه واشر ELISA اطمینان حاصل كرد.
شیكر ELISA SHAKER) ELISA)
تكان دادن میكروپلیت ها )shaking( از مهم‌ترین بخش های تكنیك ELISA است، چرا كه تاثیر زیادی در تغییر رنگ محیط آنزیمی پس از افزودن محلول اسیدی دارد. استفاده از روتاتور معمولی با قطر چرخش زیاد و تعداد دور كم و در نتیجه تكان دادن آهسته میكروپلیت‌ها باعث خوب مخلوط نشدن معرف‌ها و در نتیجه ادامه و پیشرفت جزئی واكنش در طی زمان و به روز خطا می‌شود. همچنین تكان شدید این پلیت ها نیز باعث آلوده شدن چاهك های میكرو پلیت با هم می‌شود. شیكر ELISA دستگاهی است كه برای مخلوط كردن محتویات میكروپلیت‌ها به كار گرفته می شود. شیكر ELISA با حركت سریع با قطر چرخش كم باعث اختلاط مناسب معرف‌ها و در نتیجه پیشرفت واكنش در طی زمان می‌شود. شیكرهای امروزی مجهز به سیستم كنترل زمان و كنترل دور به صورت دیجیتال است.
واشر ELISA washer)ELISA)
از دیگر مراحل مهم تست ELISA ، شستشو است كه در هر مرحله از تست به منظور دفع و تخلیه كامل مولكول‌های غیر اختصاصی از محیط واكنش انجام می گیرد. شستشو به دو صورت دستی و خودكار انجام می شود. ابتدایی ترین روش شستشو، شستشوی دستی است بدین ترتیب كه مایع شستشو را با پیپت بر روی چاهك ها ریخته و سپس آن را در سینك خالی می كنند. فشار بالای شستشو در روش دستی كه به علت تخلیه سریع بافر به وجود میآید، منجر به جداشدن و حذف اتصالات اختصاصی از كف چاهك‌ها و كاهش كاذب می‌شود، همچنین فشار پائین‌شست‌شو ناشی از تخلیه آهسته بافر، باعث عدم دفع كامل اتصالات غیر اختصاصی و افزایش كاذب جذب نوری می‌شود. بهتر است در روش دستی تا نزدیك لبه فوقانی چاهك ها از محلول شستشو پر شود، در صورت پر شدن لب به لب چاهك‌ها، احتمال آلودگی چاهك به چاهك افزایش پیدا می‌كند. همچنین  باید از سرریز شدن محلول شستشو، ایجاد حباب هوا در چاهك‌ها و تماس با كف چاهك جلوگیری كرد. در هنگام تخلیه چاهك‌ها نیز باید مكش و تخلیه به طور كامل انجام شده و دقت شود كه حتی ذره ای از مایع بافر در كف چاهك‌ها باقی نماند. اما این روش شستشو (شستشوی دستی) بسیار وقت گیر بوده و خطر آلودگی محیط و كاربر را در پی دارد. از این رو دستگاه‌های خودكار واشر ELISA برای شستشوی پلیت ها به وجود آمده است كه علاوه بر دقت و ایمنی بالاتر، سریع‌تر و راحت‌تر عمل شستشو را انجام می دهند. این دستگاه‌ها در انواع مختلف 8 یا 12 كاناله، تك سوزنه و دوسوزنه موجود است. در انواع دو سوزنه، یك سوزن برای ریختن و دیگری برای خالی كردن محلول شستشو استفاده می‌شود بدین ترتیب كه یك سوزن به طور دائم در حال مكش است تا اگر مایع شوینده بیشتری در هنگام پر كردن وارد چاهك ها شد ، آن‌را خالی كند  و این در حالی‌است كه در مدل تك سوزنه تمامی اقدامات توسط همان یك سوزن صورت می گیرد.
خواننده ELISA reader) ELISA)
خواننده ELISA در واقع یك دستگاه فتومتر است كه در آخرین بخش از تست ELISA به طور اختصاصی برای خواندن نمونه های مربوطه طراحی شده است. وظیفه آن طیف‌سنجی نوری یا خوانش دانسیته نوری واكنش ELISA است. طول موج مشخصی از نور از پائین درون چاهك می‌گذرد، در مسیر آن فیلتر مناسبی باتوجه به نوع آنزیم و نوع سوبسترای آنزیم جهت دستیابی به طول موج مطلوب قرار داده می شود. در بسیاری از خوانشگرها سیستم تك موج یا دو موج است و جهت برطرف سازی نقص سیستم نوری ، تغییرات چاهك به چاهك حجم نهایی در چاهك ها، تصحیح جذب نوری به طور خودكار صورت می گیرد . این عمل توسط نوع خاصی از فیلترتحت عنوان فیلترهای تفاضلی صورت می گیرد. خوانش میزان جذب محتوی چاهك‌ها توسط خواننده ELISA الزاما بایستی در زمان تعیین شده انجام شود. بعضی از دستگاه‌های خواننده ELISA قابلیت برنامه‌ریزی زمانی، نوع تشخیص و كنترل و در نهایت مشخص كردن مثبت یا منفی بودن نمونه‌های مجهول را دارا هستند.  ‌
امروزه انواع مختلفی از خوانشگرها برای پلیت ها ی ELISA در بازار موجود هستند اكثر این خوانشگرها یك ستونی  یا 96 خانه (یك پلیتی) بوده كه اكثرا خودكار و تعداد اندكی نیز دستی هستند. این دستگاه‌ها دارای فیبرهای نوری هستند. در دستگاه‌های خواننده انتخاب طول موج توسط فیلترها یا گریدها (گریتینك ساختارهایی كه با تابیده شدن نور به آن‌ها، تنها نور با طول موج خاصی ازآن‌ها ساطع می شود) انجام می شود. برای چاپ نتایج نمونه‌های موردآزمایش ، یا دستگاه خود دارای پرینتر است یا می توان آن‌را به پرینتری متصل كرد. همچنین می توان جهت انجام محاسبات بیشتر خواننده ELISA را به كامپیوتر وصل كرد





نوع مطلب : تستهای آزمایشگاهی، 
برچسب ها : همه چیز در مورد تست الایزا ELISA،
لینک های مرتبط :
          
1391/02/25
1398/04/1 16:12

You actually revealed that wonderfully!
cialis professional yohimbe cialis daily dose generic cialis professional yohimbe cialis 5 mg para diabeticos cialis vs viagra cialis mit grapefruitsaft cialis sicuro in linea cialis taglich cialis online click now buy cialis brand
1398/03/30 14:27

Appreciate it! An abundance of advice!

when will generic cialis be available cialis generico en mexico chinese cialis 50 mg cialis farmacias guadalajara cialis 05 look here cialis cheap canada overnight cialis tadalafil cialis 20 mg effectiveness cialis generico postepay cialis rckenschmerzen
1398/03/29 20:35

Nicely put. Thanks a lot!
only now cialis for sale in us cialis bula cialis lilly tadalafi cialis canada on line where cheapest cialis order generic cialis online overnight cialis tadalafil generico cialis mexico only best offers cialis use cialis flussig
1398/03/29 04:19

Nicely put. With thanks.
cialis online nederland cialis italia gratis click now cialis from canada enter site 20 mg cialis cost precios de cialis generico generico cialis mexico get cheap cialis click now buy cialis brand cialis herbs cialis uk next day
1398/03/27 00:18

Many thanks! Awesome information.
free generic cialis cialis et insomni cialis tadalafil generic cialis 20mg uk we like it cialis soft gel cialis daily dose generic cialis 100mg suppliers prezzo di cialis in bulgaria look here cialis order on line 200 cialis coupon
1398/03/26 10:09

Kudos, Plenty of postings.

weblink price cialis cuanto cuesta cialis yaho where do you buy cialis 5 mg cialis coupon printable cialis vs viagra cialis herbs generic cialis 20mg uk cialis 5 mg schweiz buying cialis on internet cialis tadalafil
1398/03/25 20:28

Kudos! A lot of content.

purchase once a day cialis cialis wir preise il cialis quanto costa how does cialis work buying brand cialis online weblink price cialis free cialis click now buy cialis brand cialis cipla best buy buy cialis
1398/03/25 06:21

You actually said it well!
cialis daily reviews cialis 05 cialis patent expiration order generic cialis online cialis rezeptfrei sterreich cialis 30 day trial coupon recommended site cialis kanada click now buy cialis brand chinese cialis 50 mg overnight cialis tadalafil
1398/03/24 01:43

You revealed it adequately!
cialis 5 effetti collaterali cialis super acti wow look it cialis mexico order cialis from india cialis wir preise cialis 5mg generic cialis cialis super acti buying brand cialis online order generic cialis online
1398/03/23 12:04

Incredible tons of fantastic facts.
only now cialis 20 mg precios de cialis generico cialis para que sirve 5 mg cialis pharmacie en ligne cheap cialis tadalafilo how does cialis work cialis for sale cialis canadian drugs cialis rezeptfrei
1398/01/24 05:50

Many thanks! Wonderful stuff!
best canadian pharmacies online canadianpharmacy pharmacy canada online prescriptions canadian medications list most reliable canadian pharmacies prescription drugs without prior prescription canadianpharmacyusa24h is it legal canadian discount pharmacies in canada canadian pharmacy online 24 canadian pharmacy no prescription
1397/09/15 15:49

Wow all kinds of wonderful tips.
cialis australian price generic cialis soft gels cilas overnight cialis tadalafil cialis canadian drugs cialis 5 mg cialis kamagra levitra tadalafil india cialis 100mg cost cilas
1397/09/13 18:41

You mentioned it effectively.
cialis rckenschmerzen cialis great britain buying brand cialis online prescription doctor cialis buy cialis uk no prescription india cialis 100mg cost cialis purchasing cialis generic are there generic cialis price cialis best
1397/09/12 19:37

Wonderful stuff. Thank you.
look here cialis order on line buy name brand cialis on line cialis daily cialis prices in england cialis 5 mg funziona cialis mit grapefruitsaft cialis generisches kanada safe dosage for cialis order cialis from india cialis cost
1397/09/11 19:08

Nicely put. Thank you!
wow cialis tadalafil 100mg generic cialis tadalafil cialis without a doctor's prescription we choice cialis uk where cheapest cialis generic cialis in vietnam generic cialis in vietnam low dose cialis blood pressure low dose cialis blood pressure callus
1397/09/10 19:27

Thanks a lot. A good amount of write ups!

cialis canada price cialis per pill viagra vs cialis cilas tesco price cialis side effects for cialis online prescriptions cialis weblink price cialis how much does a cialis cost low dose cialis blood pressure
1397/09/9 19:03

Thanks a lot. Quite a lot of advice.

cialis daily reviews online cialis price cialis wal mart pharmacy cialis baratos compran uk if a woman takes a mans cialis comprar cialis 10 espa241a canadian cialis we use it 50 mg cialis dose generic cialis soft gels cialis 200 dollar savings card
1397/09/9 07:16

Cheers. I appreciate it.
cuanto cuesta cialis yaho cialis manufacturer coupon viagra cialis levitra cialis australian price cialis super acti acquistare cialis internet cialis pills cialis patentablauf in deutschland click now buy cialis brand generic cialis pill online
1397/09/8 08:22

You stated it wonderfully!
viagra vs cialis vs levitra walgreens price for cialis cialis 5mg billiger purchasing cialis on the internet cialis mit grapefruitsaft acheter du cialis a geneve effetti del cialis order cialis from india tadalafil 20mg cialis 30 day sample
1397/09/7 19:31

Point certainly regarded..
cialis online warnings for cialis cialis prices does cialis cause gout american pharmacy cialis cialis generika cialis 5 mg schweiz where do you buy cialis cialis preise schweiz precios de cialis generico
1397/07/11 06:19

Nicely put. Thank you!
preis cialis 20mg schweiz generic cialis at walmart cialis authentique suisse cialis daily new zealand brand cialis generic brand cialis nl cialis billig cialis prezzo al pubblico if a woman takes a mans cialis buying cialis on internet
1397/07/9 05:06

You definitely made your point!
non 5 mg cialis generici cialis generico online cialis wir preise cialis for sale cialis 20mg preis cf cialis authentique suisse cialis australia org no prescription cialis cheap cialis 10mg prix pharmaci cialis kaufen
1397/07/1 06:54

You actually reported it well!
pharmacy canada reviews buy viagrow canadian rxlist canadian medications, liraglutide drugs for sale in mexico online pharmacies india canada viagra canadian pharmacy canada viagra drugstore online india
1397/06/14 11:38

Whoa all kinds of fantastic information.
drugstore online reviews canada medication canadian discount pharmacies in ocala fl canadian medications canadian pharcharmy online trusted pharmacy canada scam no 1 canadian pharcharmy online trust pharmacy canada reviews pharmacy canada best buy viagra online usa
1397/06/13 14:03

Wonderful information. Appreciate it.
how to get viagra with prescription where to purchase viagra buy viagra with prescription online how to get prescription viagra how do i order viagra online order viagra online without a prescription buy viagra cheap prices honest place to buy viagra buy viagra online cheap uk buy viagra online uk
1397/06/12 11:29

Nicely put. Thanks!
tadalafil generic 5 mg cialis pharmacie en ligne generic cialis 20mg uk cialis ahumada link for you cialis price warnings for cialis buy cialis online nz prescription doctor cialis cialis 5 mg effetti collateral cialis per paypa
1397/03/7 11:50

Excellent posts. Thanks.
look here cialis order on line when can i take another cialis cialis 5 mg scheda tecnica cialis prezzo al pubblico cialis from canada cialis dosage cialis generika 5 mg cialis pharmacie en ligne cialis italia gratis get cheap cialis
1397/02/5 08:33

Point well utilized.!
order online viagra viagra without presc uk sildenafil uk buy viagra prescription buy viagra cvs where do i buy viagra buy viagra from usa where to buy viagra without a prescription sildenafil online uk where can i order viagra online
1397/01/18 17:48

With thanks! Excellent information.
cialis online overnight cialis tadalafil buying brand cialis online cialis online canadian drugs generic cialis cialis vs viagra we choice free trial of cialis opinioni cialis generico rezeptfrei cialis apotheke precios cialis peru
1397/01/4 22:43

You actually stated that really well.
prix cialis once a da cialis generic availability prezzo cialis a buon mercato try it no rx cialis cialis kaufen bankberweisung cialis pills cialis taglich cipla cialis online miglior cialis generico costo in farmacia cialis
 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر


نمایش نظرات 1 تا 30



آمار وبلاگ
  • کل بازدید :
  • بازدید امروز :
  • بازدید دیروز :
  • بازدید این ماه :
  • بازدید ماه قبل :
  • تعداد نویسندگان :
  • تعداد کل پست ها :
  • آخرین بازدید :
  • آخرین بروز رسانی :
ابزار
Online User

چت



استخاره آنلاین با قرآن کریم

فال امروز

تعبیر خواب آنلاین

Google Pagerank, SEO tools
شبکه اجتماعی فارسی کلوب | Buy Website Traffic