وب هکس

میکروبیولوژی 88 لاهیجان - تشخیص بیماری تیلریوز به روش ایمونوفلورسنس غیر مستقیم:
میکروبیولوژی 88 لاهیجان
صفحه نخست       پست الکترونیک          تماس با ما              ATOM            آپدیت روزانه nod32
گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من گروه طراحی قالب من




درباره وبلاگ


به یاد ورودی های 88 لاهیجان ♥

مدیر وبلاگ : مصطفی
نویسندگان
نظرسنجی
نظرتون راجع به این وب چیه؟










تعداد بازدید :
تیلریا انگل تك یاخته أی اجباری داخل سلولی تمام خانواده گاوهای وحشی و اهلی (  Bovidae ) در جهان میباشد. و بعضی از گونه ها نشخواركنندگان كوچك را نیز مبتلا می نماید. بوسیله كنه های خانواده Ixodidae  منتقل میشوند و دارای زندگی پیچیده ای در مهره داران و بی مهره ها میباشند. شش گونه تیلریا گاو را آلوده میكند كه دو تا از آنها بیماری زایی بیشتری دارند : اولی بنامT. parva  كه بیماری East coast fever  , Corridor disease , Zimbabwean theileriosis  را ایجاد و دومی       T. annulata باعث بیماری Tropical theileriosis میشود.

دیگر گونه ها كه شامل  T. sergenti, T. buffeli, T. orientalis, T. taurotragi, T. mutans  هستند معمولا بیماری زایی خفیفی ایجاد میكنند. گونه T. velifera غیر بیماری زا است. اغلب این گونه ها پس از آلوده كردن دام ایجاد دام ناقل در دامهای بهبود یافته را مینمایند اما هیچ نوع داده وآماری در رابطه با نقش این ناقلین در انتقال بیماری در حالت طبیعی وجود ندارد.

گاوهای بومی درمناطق بومی آلوده ممكن است بیماری را تحمل نموده و یا به بیماری خفیف و تحت كلینیكی مبتلا شوند. اما گاوهای غیر بومی حسا س بوده و در صورت ابتلا علائم شدیدی نشان داده و یا تلف می شوند.

همانطوریكه قبلا هم گفته شد شیزونت ها در گسترش تهیه شده از غدد لنفاوی مشخصه خوبی برای آلودگی با  T. parva,  T. annulata میباشد. شیزونت گونه  T. taurotragi   در گسترش رنگ آمیزی شده بوسیله گیمسا بخوبی قابل تشخیص نمیباشد.شیزونت  T.mutans نسبت به شیزونت  T. parva  دارای هسته های بزرگتر، مسطح وبی قاعده میباشد.

فرم پیروپلاسمی  T. parva  ,  T. annulata  و T. mutans   شبیه بهم میباشد. اما معمولا           T. annulata ,  T. mutans  بزرگتر و اغلب در حال تقسیم دیده میشود. T. velifera  ممكن است بوسیله یك پرده حجاب مانند تشخیص داده شود.

تشخیص بیماری وابسته به علائم كلینیكی ، شدت بیماری و گستردگی ناقلین یا كنه ها و بررسی لامهای تهیه شده ( گسترش خون و یا گسترش غدد لنفاوی ) میباشد. غیر از فرمهای مختلف داخل گویچه قرمزی  در گسترشهای خونی، شیزونت مشخصه مهم و خوبی در آلودگی با گونه های ‏T. Parva و T. annulata  درگسترشهای تهیه شده از غدد لنفاوی میباشد. سلولهای آلوده ممكن است در گسترشهای فشاری  Impression  smears  تمام بافتها دیده شوند.

بیماریزایی:

شیزونت گونه T. parva  ابتدا در مرحله پاتوژنیك باعث افزایش سلولهای سیستم لنفاوی Lymphoproliferative  شده و بعد از آن باعث تخریب سلولهای فوق Lymphodestructive  میشود. حیوان مبتلا دارای علائم تورم غدد لنفی، تب، مقداری افزایش تنفس، تنگی نفس و گاهی اسهال میباشد. ضایعات بعد از مرگ شامل تورم و پرخونی غدد لنفاوی، ذات الریه بینابینی Interstitial pneumonia  و ادم مابین لبی interlobular oedema  ، ضایعات تخریشی erosion ,  ulcer  در شیردان و التهاب روده بهمراه نكروز غدد پیرز peyer´s  patches  و در حالتهای طولانی تر نفوذ سلولهای لنفاوی lymphocytic infiltration  به كلیه ها كه شبیه سكته كلیوی infarct  بنظر آمده و یا بهمراه ترمبوز و ischaemic necrosis میباشد. در حیوانات بهبود یافته گاهی در اثر عود بیماری سندرم عصبی چرخش   Turning sickness دیده می شود.

خصوصیات بیماری زایی در اثر شیزونت T. annulata تقریبا شبیه  ‍T. parva می باشد ولی مرحله پیروپلاسمی ممكن است پاتوژنیك تر بوده و باعث كم خونی و زردی شود.

  تشخیص سرولوژیكی :  

 تشخیص وجود آنتی بادی بصورت غیر مستقیم بوسیله IFA ( indirect fluorescent  antibody)  

بطور گسترده برای تشخیص گونه های مختلف تیلریا  بكار می رود. تشخیص نوع آلودگی بخصوص آلودگی با ‍T. parva  چندان در بین روشهای ایمنولوژی قابل تمایز نمی باشد. بهترین روش سرولوژی قابل تمایز مابین گونه های تیلریا آزمایش غیر مستقیم پادتن فلورسانس IFA  ( Indirect Fluorescent Antibody )  می باشد. در این آزمایش هر دو مرحله شیزونت و پیروپلاسمی بوسیله لام تهیه شده و یا در محلول قابل بررسی می باشند. برای نگهداری محلول یا لامهای تهیه شده در مرحله شیزونتی دمای  انجماد (20- تا 70- ) استفاده میشود ولی در مرحله پیروپلاسمی برای نگهداری محلول از دمای 4 درجه یخچال و برای لامها از دمای انجماد میتوان استفاده كرد.

 سرمهای مورد آزمایش را با ماده bovine lymphocyte lysate  رقیق میكنند و با محلول آنتی ژنی در انكوباتور میگذارند و بعد  ضد ایمنوگلوبولین متصل گاوی anti-bovine immunoglubolin conjugate  افزوده میشود.

 الف- تهیه لام یا اسلاید آنتی ژن شیزونت

آنتی ژن مورد استفاده برای schizont  IFA test  ازتیره سلولی شیزونت لیمفوبلاستوئید Lymphoblastoid  گرفته میشود. كشتهای سلولی را كه دارای رقت 200 میلی لیتر شیزونت در یك لیتر شیزونت های آلوده  ( به T. parva  ویا T. annulata  بوده و حاوی ده میلیون سلول در هر میلی لیتر و حداقل 90% سلولها آلوده میباشند ) باشد را سانتریفیوژ كرده ( بمدت 20 دقیقه در سرعت 2000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه ) و مایع روئی را دور ریخته و سلولهای ته نشین شده را با 100 میلی لیتر بافر   ( Phosphate buffered saline) PBS  در دمای 4 درجه و pH  7.2 تا 7.4 مخلوط و دوباره سانتریفیوژ میكنیم. این روش شستشو را سه بار تكرار كرده و در آخرین دفعه سلولهای ته نشین شده را با 100 میلی لیتر PBS مخلوط كرده تا غلظت نهائی حدودCELL/ML 7 10 درآید.

گسترش نازك از محلول سلولی را روی اسلاید حفره دار ( از جنس تفلن )‌تهیه كرده ویا روی لام معمولی را با استفاده از  لاك ناخن تقسیم كنیم . هر گسترش باید دارای 50 تا 80 سلول سالم در هر دید میكروسكوپی Field ‌باشد  (‌وقتیكه با بزرگنمایی 40 با روغن Immersion بررسی شود) .بوسیله پی پت 100μl آنتی ژنها را با مكش یكدفعه  روی لام ریخته كه پس از توزیع محلول شیزنت یا پیروپلاسم یك لایه  Monolayer در هر كدام باقی می ماند. اینكار را برای هر حفره انجام داده تا مایع تمام شود. بااین روش تقریبا“‌می توان 600لام با كیفیت خوب كه حاوی 6 هزار سلول در هر نقطه آنتی ژن باشد بدست آورد . گسترشها را درمعرض هوا خشك كرده ودراستن بمدت ده دقیقه ثابت كرده (‌Fixation)‌ وبطور جداگانه دردستمال كاغذی پیچیده و سپس در كاغذ آلومینیم (‌فویل آلومینیم ‌) ‌وبعد در محفظه ضد آب و هوا دردمای20-  درجه سانتیگرادیا 70 - درجه سانتیگراد نگه می داریم . دردمای –20 درجه سانتیگراد بمدت یكسال قابل استفاده هستند ودردرمای –70 درجه سانتیگراد بمدت طولانی تر (‌دردمای یخچال 4 درجه سانتیگراد بمدت چهارماه قابل نگهداری هستند).

 ب- محلول آنتی ژن شیزونت

 ابتدا 500 میلی لیتر از محلول T.annalataیا T. parva سلولهای آلوده با غلظت 10 6cell/ml سلول سانتریفیوژكرده (‌در 1500 g دور دردقیقه برای ده دقیقه در دمای 4 درجه )‌ وسلولهای ته نشین شده در100سی سیPBS سرد دوبار شستشو می دهیم.

قابلیت زنده بودن سلولها را بوسیله ائوزین Eosin یا Trypan blue بررسی میشود (‌كه باید بیش از %90‌باشد )‌محلول سلولها باید درمحلول سرم فیریولوژی سرد رقیق شود تا غلظت 10سلول (/ml Cell) بدست آید دراین حجم ، ‌دوبرابرآن را محلول سرد شده حاوی 80%‌ استن و 1/0 %  فرمالین در PBS قطره قطره اضافه كرده (‌در درمای –20 درجه )‌تا درمدت 24 ساعت به تثبیت رسد.

سلولهای ثابت شده را سه بار شستشو داده (‌در سرم فیزیولوژی سرد شده دردمای 4 درجه ) و‌در 200 دور دردقیقه بمدت 20 دقیقه سانترفیوژ میكنیم. بعد از آخرین شتشو سلولهای ته نشین شده را در سرم فیولوژی رقیق كرده تا غلظت 107/ml بدست آید . بمیزان 5/0 سی سی سلولهای ثابت شده را جدا جدا برداشت و تقسیم می كنیم .

تهیه اسلاید حاوی آنتی ژن پیروپلاسم:

مرحله پیرپلاسمی گونه های تیلریا را نمی توان دركشت سلول نگهداری یا تهیه نمایند. زیرا آنتی ژن پیروپلاسمی باید از حیوانات زنده آلوده تهیه شود و عفونتهای تجربی بوسیله تزریق زیر پوستی با اسپروزئیت  یا كنه های آلوده باT.parva T.taurotragi  ,T.annulata , صورت میگیرد. آلودگی گروه انگلی T.sergenti/ T.buffeli/ T.orientalis ,T.mutans or T.velifera  بوسیله تزریق داخل رگی  خون حیوان ناقل به گاو یا گوساله طحال برداشته و یا تماس با كنه آلوده ایجاد می شود. وقتیكه آلودگی پیروپلاسمی بیش از 5% ‌باشد، صد میلی لیتر خون آلوده آغشته با مواد ضد انعقاد را بخوبی با PBS مخلوط می كنیم . این مخلوط را سانترفیوژ كرده (‌با500دور در دقیقه برای ده دقیقه)‌ و بعدپلاسما و Buffy Coat را جدا كرده و RBC  های باقی مانده را بادولیتر PBS رقیق می كنیم. سپس دوباره سانترفیوژ كرده وهمینطور Buffy coat را جدا میكنیم . این عمل رابرای چهار بار تكرار می كنیم و بعد از پنجمین ششتشو، مقداری از RBC های جمع شده Packed RBC را با PBS  مخلوط كرده واز آن 5μl روی هر اسلاید می گذاریم. نقاط خشك شده را با متانول تثبیت كرده وبا رنگ آمیزی گیمسا رنگ میكنیم ونهایتا زیرمیكروسكوپ نوری بررسی می كنیم  . تقریبا ده هزار اسلاید آنتی ژنی (‌صد هزار نقاط آنتی ژن ) ا ز100سی سی خون آلوده‌ تهیه می شود.  اسمیرهای آنتی ژنی را در دمای اتاق خشك كرده وبعد در دمای 4 سانتیگراد درجه در استن بمدت ده دقیقه فیكس میكنیم. اسمیرهای فیكس شده شبیه اسلایدهای آنتی ژنی شیزونت نگهداری میشوند.

 محلول یا سوسپانسیون حاوی پیروپلاسم :‌

 یك روش تهیه آنتی ژن برای T.parva  قبلا“‌شرح داده شد دراین روش صد میلی لیتر از خون حیوانیكه شدیدا“‌ در مرحله آلودگی پیروپلاسمی باشد گرفته و مانند آنچه شرح داده شد،گلبولهای قرمز تجمع كرده را به PBS اضافه كرده تا محلول 5%‌ بدست آید.- در مراحل فوق باید آنتی ژن را استانداردكرد-

تهیه lysate‌Bovine Lymphocyte   :  این ماده طبق روش Godderis et al. برای بررسی محلول آنتی ژن T. parva  بكار می رود . ابتدا یك گوساله سه ماهه كه طحال آنرا برداشته اند را درنظر گرفته و از طریق تماس با كنه آلوده می كنیم  وروزانه بمدت چهارهفته با رنگ آمیزی گیمسا بررسی میكنیم . نهایتا بعد از مرگ یا كشتن حیوان از تیموس و غددلنفاوی نمونه برداری می كنیم .

بافتها را به قطعات كوچكتر تقسیم كرده ودر PBS سرد ( در دمای 4 درجه) بهمراه %45 /.0  مواد ضد انعقاد نگهداری میكنیم . سلولها را از بافت بوسیله پارچه MUSLIN جدا كرده و سه بارشتشو با مخلوط PBS-EDTA میدهیم و در دور 200 بمدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ میكنیم . لینفوسیتهای شسته شده را با PBS كه عاری از EDTA  باشد، مخلوط می كنیم تا غلظت نهائی CELL/ML  107*5 بدست آید .

روش كار برای تشخیص آنتی بادی فلورسانس :

اسلاید شیزونت یا پیروپلاسم را از دمای انجماد، 20- درجه سانتیگراد در آورده و بمدت 30 دقیقه در دمای یخچال، 4 درجه گذاشته و سپس 30 دقیقه دیگر در دمای اتاق میگذاریم.

بوسیله پی پت پاستور 100/μl آنتی ژن را روی هر لام ریخته ودردمای اتاق 37 درجه خشك می كنیم . میتوان برای تلعلع بهتر و دید بهتر از Evansblue  نیزبهمراه رنگ فلورسانس استفاده كرد و بعد در گلسیرول 50% در pH 8 میگذاریم تا رنگ Fluorescein  isothiocyanate  بمدت طولانی تر و عمیق تر اثر گذارد . اسلایدهای تهیه شده تا 72 ساعت در دمای 4 درجه در تاریكی قابل نگهداری و استفاده میباشند. بدنبال عفونت با اسپروزئیت ها آنتی بادی های تولید شده بر علیه T.parva و T.annulate  ابتدا" بین روزهای دهم تا 14 برعلیه شیزونت ودر بین روزهای 15-21 بر علیه  پیروپلاسم قابل تشخیص می باشند. پادتنها بعد از بهبودی ناپدید می شوند ووابسته به فاكتورهای متفاوتی از جمله وضعیت ناقل، ‌فاصله مابین درمان، درمعرض قرار گرفتن و تماس دوباره با كنه آلوده تغییر می كنند. معمولا“ ‌4 تا 6 ماه بعد از آلودگی آنتی بادی پائین می آید (‌در صورتیكه تماس دوباره پیش نیاید).

بدنبال آلودگی با T.mutans  آنتی بادی در روزهای دهم تا 15 قابل اندازه گیری بوده و بعد از 12-24 ماه پائین میآید. 





نوع مطلب :
برچسب ها :
لینک های مرتبط :
          
1390/03/12
1396/12/5 20:53
با تشکر برای ارسال عجیب و غریب! من واقعا از خواندن آن لذت بردم، ممکن است شما یک نویسنده بزرگ باشید. به یاد داشته باشید
وبلاگ شما و قطعا خیلی زود باز خواهد گشت. من می خواهم شما را تشویق کنم
کار بزرگ شما، آخر هفته خوبی داشته باشید!
1396/12/5 07:58
سلام! آیا می دانید اگر هر پلاگین برای بهینه سازی موتور جستجو کمک کند؟ من تلاش می کنم وبلاگم را برای برخی از کلمات کلیدی هدفمند رتبه بندی کنم، اما من هستم
نتایج بسیار خوبی را نمی بینم. اگر می دانید از هر سهم لطفا به اشتراک بگذارید.

متشکرم!
1396/06/18 06:24
Hmm it seems like your site ate my first
comment (it was extremely long) so I guess I'll just sum it up what
I wrote and say, I'm thoroughly enjoying your blog. I too am an aspiring blog blogger but I'm still new to everything.
Do you have any recommendations for inexperienced blog writers?
I'd certainly appreciate it.
 
لبخندناراحتچشمک
نیشخندبغلسوال
قلبخجالتزبان
ماچتعجبعصبانی
عینکشیطانگریه
خندهقهقههخداحافظ
سبزقهرهورا
دستگلتفکر





آمار وبلاگ
  • کل بازدید :
  • بازدید امروز :
  • بازدید دیروز :
  • بازدید این ماه :
  • بازدید ماه قبل :
  • تعداد نویسندگان :
  • تعداد کل پست ها :
  • آخرین بازدید :
  • آخرین بروز رسانی :
ابزار
Online User

چت



استخاره آنلاین با قرآن کریم

فال امروز

تعبیر خواب آنلاین

Google Pagerank, SEO tools
شبکه اجتماعی فارسی کلوب | Buy Website Traffic